自从彻底消灭了死对头施莱德之后，纽约市恢复往日安宁，斯普林特老师为了增强这支地下护卫队的战斗力，把四龟中本事最扎实的达芬奇送往南非进修忍术。没了坏人作恶，神龟们似乎也派不上太大用场，达芬奇走后三个兄弟过着百无聊赖的生活。

　　大反派马科斯·温特斯的出现，让老鼠大师斯普林特忧心忡忡，他的目标是统治整个世界。马科斯借助天文以及些许带些奇幻传说色彩的三千年一遇的“九星连珠”，将传说中的一支强大的远古怪兽军团复活，并带到了当今的人类社会。有着“鬼脚忍者”之称的一伙恶人在头领卡拉的带领下也前来与马科斯结盟。两伙恶势力共同在纽约城里四处作乱破坏，见此情景，玩耍中的忍者神龟重新组队，在极具正义感的漂亮女记者艾普丽尔以及好友凯西·琼斯的帮助下，忍者神龟们再次挥起手中的利刃，为正义而战殊死一搏……